Sicurezza Biologica

Introduzione

Esposizione al rischio biologico

Uso deliberato di microrganismi

Rischio potenziale di esposizione

Le più importanti attività lavorative che possono comportare rischio potenziale di esposizione ad agenti biologici sono le seguenti:

• Attività in industrie alimentari
• Attività nell'agricoltura
• Attività nelle quali vi è contatto con animali e/o prodotti di origine animale
• Attività nei servizi sanitari, comprese le unità di isolamento e post mortem
• Attività nei laboratori clinici, microbiologici, veterinari e diagnostici (nei laboratori di microbiologia sono presenti entrambi i rischi, quello potenziale e quello legato all'uso deliberato di microrganismi)
• Attività negli impianti di smaltimento rifiuti e di raccolta di rifiuti speciali potenzialmente infetti
• Attività negli impianti per la depurazione delle acque di scarico

Gli agenti biologici, definiti secondo il D.Lgs 81/2008, Titolo X come "qualsiasi microrganismo anche geneticamente modificato, coltura cellulare ed endoparassita umano che potrebbe provocare infezioni, allergie, intossicazioni", sono stati classificati secondo un criterio di pericolosità tenendo conto delle condizioni prevalenti nell'area geografica presa in considerazione. L'allegato XLVI riporta l'elenco degli agenti biologici con la relativa attribuzione ai gruppi 2, 3 e 4.

Gli obblighi del datore di lavoro, il contenimento e le misure di prevenzione e protezione dei lavoratori sono condizionati dalla differente pericolosità dei microrganismi.

Gli adempimenti sono diversi a seconda che si utilizzino agenti biologici rispettivamente dei gruppi 2 e 3 da un lato e 4 dall'altro. Nel primo caso il datore di lavoro dovrà limitarsi a darne comunicazione alla Unità Sanitaria Locale almeno 30 giorni prima dell'inizio dell'attività; invece nel caso di microrganismi del gruppo 4 è necessaria una specifica autorizzazione da parte del Ministero della Sanità.

L'utilizzo di microrganismi geneticamente modificati è regolamentato con il Decreto Legislativo 206/01 (vedi qui per una sintesi della normativa a tale riguardo).

Norme generali

1. Proibito fumare, mangiare, bere e tenere cibo o tabacco in tutte le zone dove sono tenuti o maneggiati materiali biologici pericolosi.
2. Ogni volta che si maneggiano sangue, liquidi biologici e qualsiasi altro materiale proveniente dall'uomo o dagli animali indossare guanti monouso in vinile (questi ultimi da preferire perchè non provocano allergie), indumenti protettivi quali camice con maniche lunghe e eventuale sovracamice idrorepellente in TNT (tessuto non tessuto), occhiali e visiera.
3. Togliersi gli indumenti protettivi e i guanti quando si lascia il laboratorio. I guanti non devono mai essere riutilizzati.
4. Non toccare le maniglie delle porte e altri oggetti del laboratorio con i guanti con cui si è maneggiato materiale potenzialmente infetto.
5. Rispettare le norme igieniche, lavarsi le mani frequentemente e ogni qualvolta ci si contamini o immediatamente dopo aver rimosso i guanti.
6. Non pipettare con la bocca, usare solo pipettatrici meccaniche.
7. Prendere precauzioni per prevenire danni dovuti all'utilizzo di oggetti taglienti.
8. E' vietato reincappucciare gli aghi: è necessario riporli direttamente negli appositi contenitori.
9. Eliminare le punte delle micropipette in contenitori di plastica rigida.
10. Usare cappe adeguate per il livello di contenimento, in relazione al grado di pericolosità dei microrganismi e per tutte quelle procedure che possono provocare aerosol.
11. Decontaminare le superfici di lavoro e gli strumenti ogni giorno o dopo uno spandimento. Si possono utilizzare diluizioni di ipoclorito di sodio 1:5 (varechina comune) o altri disinfettanti in alternativa.
12. Nel caso si maneggi materiale di provenienza umana si consiglia la vaccinazione antiepatite B.
13. Nelle aree dove sono utilizzati materiali biologici pericolosi devono essere posti segnali di avvertimento per rischio.

  Aerosol

Si tratta di una miscela bifasica con una fase disperdente aeriforme ed una fase dispersa liquida o solida, avente un certo carattere di stabilità. Distinguiamo due tipi fondamentali di aerosol:

• di dispersione: polveri, spray
• di condensazione: fumi, nebbie

La disseminazione sotto forma di aerosol rappresenta una rilevante fonte di dispersione nell’atmosfera di materiale infetto e costituisce una delle più frequenti modalità di contaminazione ambientale, tanto più pericolosa in quanto non visibile.

Tutte le tecniche di laboratorio, anche le più comuni, provocano la formazione di aerosol.

Alcuni esempi di cause più importanti di dispersione nell’aria di aerosol patogeni sono i seguenti:

• centrifugazione
• flambatura (la sterilizzazione per flambatura provoca nella prima fase una microesplosione e la proiezione di particelle infette sulla mano e sulle zone circostanti)
• miscelazione
• agitazione
• espulsione di liquidi
• apertura di contenitori di materiale infetto con pressione interna diversa da quella dell’ambiente circostante
• inoculazione di materiali per via intranasale in animali
• raccolta di tessuti infetti da animali e uova
• manipolazione di forti concentrazioni o grandi volumi di materiali infetti

Date le ridottissime dimensioni delle particelle che li compongono, si diffondono rapidamente nell’ambiente: contaminano persone, superfici e strumenti, si possono insinuare nei canali di aerazione raggiungendo in breve altri laboratori, uffici e degenze anche lontane dal luogo di origine. In seguito all’inalazione di aerosol patogeni si possono così contaminare non solo l’operatore, ma i colleghi presenti nello stesso locale e altro personale presente nell’edificio.

Una drastica riduzione degli aerosol si ottiene utilizzando apparecchiature moderne e conformi alle normative vigenti (centrifughe, cappe biohazard, pipettatori automatici ecc...) progettate in funzione della sicurezza.

La cappa biohazard è uno degli elementi più importanti di contenimento fisico primario del rischio biologico durante le lavorazioni (manipolazione deliberata o rischio potenziale) per assicurare la protezione dell’operatore e del prodotto e per prevenire la dispersione di aerosol nell’ambiente.

La filtrazione assoluta dell’aria (filtri HEPA)

I filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air filter) sono in grado di trattenere il 99,999% di particelle con diametro uguale o superiore a 0,3 µm presenti nell’aria che li attraversa. Considerando che la maggior parte dei microorganismi patogeni ha un diametro superiore ai 0,5 µm, si può comprendere il successo ottenuto dai filtri HEPA nel campo della sicurezza biologica.

Questi filtri hanno reso possibile la decontaminazione dell’aria senza utilizzare sostanze chimiche o radiazioni. La maggior parte dei microrganismi patogeni ha un diametro superiore a 0,5 micrometri. I virus, sebbene siano di dimensioni nettamente inferiori, vengono trattenuti dai filtri assoluti grazie a diversi effetti fisici: dalle forze elettrostatiche, all’impatto inerziale, sino alla filtrazione meccanica della particelle di dimensioni maggiori che veicolano il virus. È bene comunque in presenza di virus utilizzare la doppia filtrazione assoluta abbinata alla filtrazione molecolare sul carbone attivo.

Il filtro HEPA ha anche la capacità di "raddrizzare" il flusso d’aria che lo attraversa a 0,45 m/sec, generando un flusso d’aria laminare, ossia unidirezionale e privo di turbolenze, ideale per creare ambienti a contaminazione controllata in cui operare su materiale sterile (es. colture cellulari, preparazioni farmaceutiche, e altro).

La possibilità di rimuovere meccanicamente le particelle presenti nell’aria compresi batteri e virus, ha reso possibile la realizzazione di cabine contro rischi biologici e di ambienti a contaminazione controllata (camere sterili e laboratori di sicurezza microbiologica). Nelle cabine di sicurezza microbiologica la zona di lavoro è mantenuta costantemente in depressione rispetto all’ambiente (la cosiddetta "tenuta dinamica") per proteggere gli operatori dal rischio di contaminazione biologica. Tutta l’aria espulsa dalla cabina viene filtrata HEPA per la protezione dell’ambiente e quindi canalizzata all’esterno dell’edificio oppure riciclata nel locale. Le cabine di sicurezza microbiologica (comunemente definite "biohazard" o identificate con l’acronimo MSC per Microbiological Safety Cabinet) sono distinte in tre classi sulla base del loro schema di funzionamento .

Le cabine di classe I sono sostanzialmente simili alle cappe chimiche aspiranti ma dotate di filtro HEPA sul canale di espulsione dell’aria. Sono ottime per la protezione del personale e dell’ambiente ma non proteggono il prodotto in esse manipolato dalla contaminazione esterna. Ingiustamente poco utilizzate in Italia, possono essere vantaggiosamente impiegate in tutti i casi in cui non sia indispensabile o prioritario proteggere il prodotto dall’aria presente in laboratorio.

Le cabine di classe II, le più diffuse, offrono un compromesso di protezione prodotto-operatore-ambiente. Mediante una barriera di aspirazione frontale, impediscono all’aria di passare dall’interno all’esterno della cabina verso l’operatore (tenuta dinamica). Un flusso laminare verticale di aria sterile protegge il prodotto nella zona di lavoro. Tutta l’aria viene aspirata, filtrata HEPA e in parte espulsa all’esterno, in parte riciclata dopo filtrazione nella zona di lavoro. Le cappe classe II si distinguono, in funzione dell’aerodinamica interna, in 4 tipi: Classe II tipo A, B1, B2 e B3. I tipi B1, B2 e B3 prevedono l’espulsione obbligatoria dell’aria all’esterno dell’edificio

Ogni tipo di cabina biohazard ha un proprio campo di applicazione: per esempio i tipi A e B3 sono indicati per rischi biologici medio-bassi (patogeni dei gruppi I-II); il tipo B1 per patogeni del gruppo II e III e per sostanze marcate con traccianti radioattivi a bassa attività; il tipo B2 per patogeni del gruppo II e III, per colture cellulari trattate con sostanze cancerogene e/o mutagene o marcate con isotopi radioattivi.

Le cabine di classe III sono dei glove-box ermeticamente chiusi ("tenuta statica"), dotati di guanti a manicotto per la manipolazione del materiale e di filtri assoluti per la filtrazione dell’aria in entrata e in uscita. La protezione è totale per il personale e l'ambiente mentre il prodotto, sebbene manipolato in ambiente sterile, è a rischio di contaminazioni crociate dovute alla turbolenza del flusso. Le cabine classe III sono poco diffuse; destinate alla manipolazione di patogeni a rischio elevato (classe IV) trovano applicazione solo presso i pochi centri di ricerca.

Principi di funzionamento e precauzioni da adottare nelle manipolazioni in cabine biohazard

• E' necessario che tutti coloro che utilizzano la cappa siano a conoscenza delle modalità per un corretto utilizzo.
• Non utilizzare la cappa se non è perfettamente funzionante e non aprire il pannello di chiusura in vetro durante l’uso.
• La barriera frontale delle cabine biohazard è la parte più critica per la protezione dell’operatore, essendo quest’ultima garantita dalla corretta velocità di ingresso dell’aria ambiente nella griglia anteriore. Conviene controllare frequentemente l’efficienza dell'aspirazione mediante lo "smoke-test" o un anemometro.
• È importante non creare turbolenze (apertura e chiusura di porte e finestre, passaggio di persone alle spalle dell’operatore, entrata e uscita dei materiali dalla cappa) per evitare la fuoriuscita verso l’esterno di aria potenzialmente contaminata.
• La zona della griglia (e sino a qualche centimetro oltre) non deve essere assolutamente ostruita per non creare turbolenze o falle nella barriera, né tantomeno deve essere utilizzata come zona di lavoro per evitare la contaminazione certa del materiale sterile da parte dell’aria ambiente non filtrata.
• La cabina biohazard non protegge l’operatore dalla contaminazione delle mani e delle braccia prodotta da schizzi e da aerosol. I camici con i polsini elastici su cui si infilano i guanti rappresentano la miglior protezione, a patto che vengano tolti con le dovute precauzioni non appena terminato il lavoro.
• Ai fini della sicurezza è importante non sovraccaricare il piano di lavoro: l’aria deve poter mantenere costante il suo flusso senza incontrare troppi ostacoli. Inoltre tutti gli oggetti e contenitori introdotti o rimossi dalla zona di lavoro devono essere sempre disinfettati.
• Esistono due tipi di piano di lavoro: quello forellinato e quello chiuso a vassoio con griglie di ripresa anteriore e posteriore.
• Il piano forellinato, che offre il vantaggio di mantenere costante il flusso laminare verticale, offre le migliori caratteristiche di laminarità, dato che in ogni punto della superficie di lavoro il flusso d’aria scende verticalmente. È particolarmente indicato per le colture cellulari e per tutte le applicazioni in cui sia utile garantire la sterilità al prodotto.
• Il piano di lavoro chiuso è utile per prevenire la contaminazione della cabina in caso di rovesciamento di liquidi, dato che con questa soluzione è possibile utilizzare telini assorbenti stesi sulla sua superficie senza alterare il flusso d’aria. È però richiesta una manualità più complessa rispetto a quella utilizzata con il piano forellinato, per prevenire le contaminazioni cosiddette "da monte" del prodotto (dovute a particelle contaminanti provenienti da oggetti già investiti dal flusso d’aria). Il flusso laminare verticale, infatti, si divide in prossimità del piano in due flussi, uno diretto verso la griglia frontale e uno verso quella posteriore, scorrendo per un breve tratto quasi in senso orizzontale. Gli oggetti posti nella fascia centrale del piano saranno investiti direttamente dal flusso d’aria sterile, mentre gli oggetti collocati nella fascia anteriore o posteriore del piano di lavoro saranno investiti da aria che ha attraversato la fascia centrale.
• L’uso del becco bunsen all’interno della cappa biohazard dovrebbe essere evitato: la corrente ascensionale d’aria calda prodotta dalla fiamma crea una significativa turbolenza nel flusso laminare con conseguente rischio di contaminazioni crociate del materiale biologico manipolato. Inoltre esiste il rischio di danneggiamento del filtro HEPA e la sterilizzazione di oggetti per flambatura provoca una microesplosione con proiezione di particelle infette nelle zone circostanti il bunsen, compresa la mano dell'operatore. Per la sterilizzazione delle anse si consiglia l’uso di inceneritori elettrici, se non e' possibile adottare materiale monouso.
• Le lampade germicide non possono sostituire la quotidiana disinfezione delle superfici contaminate, dato che le radiazioni ultraviolette agiscono solo in superficie e hanno un’efficacia assai limitata, inoltre possono determinare rischi per la salute alla cute e agli occhi, con danni a lungo termine.
• Se la cappa deve essere spenta, lasciarla in azione almeno 25-30 minuti dopo la disinfezione per essere certi che tutta l’aria sia stata trattata attraverso il filtro.

Fumigazione delle cabine microbiologiche

• prima del cambio dei filtri
• prima di ogni test fatto sulla cappa
• a intervalli regolari, in base all'uso che si fa della cappa

CARATTERISTICHE PROGETTUALI DEI LABORATORI DI BIOSICUREZZA

Per ogni gruppo di rischio il D. Lgs. 81/08 individua dei livelli di contenimento, per cui i laboratori dove saranno utilizzati i microrganismi sono definiti, in base alle loro caratteristiche progettuali come:

• Laboratorio di base – livello di biosicurezza 1 per microrganismi appartenenti al gruppo 1
• Laboratorio di base – livello di biosicurezza 2 per microrganismi appartenenti al gruppo 2
• Laboratorio di sicurezza – livello di biosicurezza 3 per microrganismi appartenenti al gruppo 3
• Laboratorio di massima sicurezza – livello di biosicurezza 4 per microrganismi appartenenti al gruppo 4

LABORATORI CON LIVELLO DI BIOSICUREZZA 1 E 2

Caratteristiche di progettazione degli spazi

• Muri, soffitti e pavimenti devono essere lisci, facili da pulire, impermeabili ai liquidi e resistenti agli agenti chimici e ai disinfettanti.
• Illuminazione adeguata, evitando riflessi e luce troppo forte.
• Superfici dei banconi unite ai muri con sostanze sigillanti, resistenti agli agenti chimici e ai disinfettanti e impermeabili all’acqua.
• Presenza di lavabi dotati di acqua corrente.
• Le porte devono rispondere agli standard antincendio, devono chiudersi da sé e avere panelli di ispezione.
• Disponibilità di un'autoclave nel laboratorio o nello stesso edificio.
• Aerazione possibilmente meccanica che assicuri un flusso d’aria entrante senza ricircolo. Se non esiste areazione meccanica, le finestre devono essere apribili.
• Sistemi di sicurezza che comprenderanno:

• • sistema antincendio
  • impianto elettrico di emergenza
  • illuminazione di emergenza
  • docce di emergenza
  • presidi di pronto soccorso
  • dotazione per il lavaggio degli occhi.  

Tabella 3. Attrezzature raccomandate

LABORATORI CON LIVELLO DI BIOSICUREZZA 3

Progettazione e dotazioni del laboratorio

Il laboratorio di sicurezza – livello di sicurezza 3 è progettato per il lavoro con microrganismi del gruppo di rischio 3, e con grandi volumi ed alte concentrazioni di microrganismi del gruppo di rischio 2, condizioni che presentano elevati rischi di aerosol o di infezione.

La sezione sulla progettazione e le dotazioni dei laboratori di base – livelli di biosicurezza 1 e 2 resta valida, eccetto dove modificata come segue.

1. Il laboratorio deve essere separato dalle aree dell’edificio aperte ai visitatori esterni.
2. L’ingresso del personale deve avvenire tramite un vestibolo che fa da filtro (sistema di ingresso a doppia porta).
3. L’accesso al laboratorio deve essere studiato per prevenire l’ingresso di insetti e di altri artropodi.
4. Le porte devono chiudersi da sé e poter essere chiuse a chiave. Possono essere dotate di un pannello a resistenza limitata da rompere in caso di emergenza.
5. Le superfici dei pavimenti, dei muri e dei soffitti devono essere resistenti all’acqua e facili da pulire. Le aperture in queste superfici (ad esempio i fori per i passaggi dei tubi) devono essere sigillate per facilitare la decontaminazione degli ambienti.
6. La stanza del laboratorio deve essere sigillabile per la decontaminazione. Le condotte dell’aerazione devono permettere la disinfezione mediante gas.
7. Le finestre devono essere chiuse e sigillate.
8. Vicino a ciascuna uscita deve essere a disposizione un lavandino con rubinetto a pedale o azionabile con il gomito.
9. Deve esserci un impianto di aerazione che crei flusso d’aria dall’esterno verso l’interno del laboratorio.
10. Il sistema di aerazione dell’edificio deve essere realizzato in modo tale che l’aria proveniente dl laboratorio di sicurezza non venga fatta ricircolare in altre parti dell’edificio. L’aria in uscita (tranne quella proveniente dalle cappe di sicurezza biologica) deve essere scaricata direttamente all’esterno in modo da disperdersi lontano dagli edifici frequentati e dalle prese d’aria. Si raccomanda di dotare gli scarichi dell’aria di filtri HEPA ("high efficiency particulate air", sistema di filtrazione ad alta efficienza delle particelle in aria).
11. Le cappe di sicurezza biologica vanno poste lontano dalle zone di passaggio e da correnti d’aria provenienti da porte, finestre e dall’impianto d'aerazione in maniera che non si creino turbolenze che possano interferire con il normale funzionamento delle cappe.
12. L’aria proveniente dalle cappe di sicurezza biologica classe I o classe II deve innanzitutto passare attraverso i filtri HEPA e successivamente dovrà essere scaricata all’esterno direttamente o attraverso l’impianto di ventilazione dell’edificio.
13. Nella stanza del laboratorio dovrebbe essere disponibile un'autoclave per decontaminare i rifiuti infetti. Se questi rifiuti devono essere portati in altre parti dell’edificio per il passaggio in autoclave, vanno tenuti in contenitori a prova di perdite dotati di coperchio.
14. La fornitura idrica deve essere dotata di sistemi che impediscono i flussi di ritorno.
15. I liquidi di scarico devono essere scaricati direttamente nella fogna.

Attrezzature del laboratorio

Le attrezzature da scegliere sono le stesse che per i livelli di contenimento 1 e 2; oltre alle cappe di sicurezza biologica di classe I o classe II può essere necessaria una cappa di sicurezza biologica di classe III per alcune operazioni su microrganismi del gruppo di rischio 3 (tabella 2)

IL LABORATORIO DI MASSIMA SICUREZZA. – LIVELLO DI BIOSICUREZZA 4

Il laboratorio di massima sicurezza – livello di biosicurezza 4 è progettato per svolgere attività con materiali infetti o esperimenti microbiologici che presentano, o sono sospetti presentare, un alto rischio sia per chi lavora in laboratorio, sia per la comunità.

Prima che tale laboratorio sia costruito e reso operativo, si deve richiedere una consulenza approfondita al Servizio di Prevenzione e Protezione. I laboratori di massima sicurezza – livello di biosicurezza 4 operativi devono essere sotto il diretto controllo dell’autorità sanitaria nazionale o di altre autorità sanitarie competenti.

INDUMENTI PER LA PROTEZIONE DA AGENTI BIOLOGICI

Tratto da: "linee guida ISPESL per la scelta e l’impiego di indumenti per la protezione da agenti biologici " (modificato)

Gli indumenti di protezione da agenti biologici (camici con maniche lunghe, completo giacca con maniche lunghe e pantaloni, tuta intera con maniche lunghe) devono essere sempre scelti tenendo conto dell’attività svolta, tuttavia ci sono alcune regole generali a cui attenersi:

• protezione delle parti anatomiche esposte che possono comprendere la base del collo, il busto, le braccia e le gambe;
• i camici devono avere lunghezza almeno al di sotto del ginocchio;
• l’indumento deve essere realizzato con maniche lunghe le cui estremità devono essere provviste di elastici e aderire ai polsi per impedire l’esposizione della parte interna delle braccia;
• gli indumenti costituiti da più parti devono essere progettati in modo tale da garantire la protezione di tutte le prevedibili posture di lavoro;
• deve sempre essere assicurata un'adeguata protezione lungo le parti di chiusura;
• gli indumenti devono essere indossati per tutto il tempo in cui permane il rischio di esposizione agli agenti biologici;
• per gli agenti biologici di gruppo 3 è consigliabile la tuta intera, che diventa obbligatoria quando si manipolano agenti del gruppo 4;
• nel caso di utilizzo di agenti biologici dei gruppi 3 e 4 le parti di chiusura degli indumenti devono essere posizionate sul retro;
• gli indumenti devono sempre adattarsi alle esigenze lavorative e devono garantire il comfort durante tutto il periodo del loro impiego.

THIS PAGE REFERENCES:
©  2000 SPP- Università di Padova - Autori: Maria Letizia Gabriele, Stefano Piovesan e Raffaele Polato
Ultima versione: luglio 2010
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